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利用RT-PCR检测SM22基因在胃癌及正常组织中的表达差异

2017-10-02 00:00:10    作者:admin    www.5alw.com

                          作者:吕中全,闫晓红,李文梅,吕有勇

【关键词】  RT-PCR检测

    【摘要】  目的  检测SM22(smooth muscle 22)mRNA在人胃癌及正常胃组织中的表达水平,探讨SM22基因与胃癌发生的关系,为进一步鉴定胃癌诊断筛查的标志物提供理论依据。方法  应用半定量RT-PCR检测42例胃癌组织及14例胃正常组织中SM22 mRNA的表达水平,并比较其差异。结果  在胃癌组织中SM22 mRNA的阳性表达率为92.86%(39/42),在正常组织中的阳性表达率为71.43%(10/14),差异无统计学意义(P>0.05)。半定量光密度计数后SM22 mRNA表达量在胃癌组织和正常组织中分别为0.86±0.14和0.32±0.22,差异有统计学意义(P<0.01)。在14对胃癌与正常配对标本中,有10对胃癌及正常组织中SM22 mRNA均表达阳性而且在肿瘤组织中表达量明显高于正常组织,有4对标本中SM22 mRNA只在胃癌组织中表达而在正常组织中表达阴性。结论  SM22 mRNA在胃癌组织中的表达量高于正常组织,提示其在胃癌发生发展中可能起到一定作用。

    【关键词】  SM22;胃癌;RT-PCR

    Expression differential and biological significance of SM22 mRNA in gastric cancer and normal tissues

        【Abstract】  Objective  To investigate the relationship between the expression level of SM22 (Smooth muscle 22) mRNA and tumorigenesis of human gastric cancer (HGC).Methods  Semi-quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) was performed to detect the expression level of SM22 mRNA in 42 gastric cancer tissues and 14 normal ones.Results  There were 92.86%(39/42) and 71.43% (10/14) positive expression of SM22mRNA in gastric cancer tissues and normal ones.There was no significant difference of the expression positive ratio between gastric cancer tissues and normal ones (P>0.05).The expression level of SM22 mRNA was 0.86±0.14 and 0.32±0.22 respectively,after being processed with semi-quantitative.There was significant difference of the expression positive ratio between gastric cancer tissues and normal tissues(P<0.05).Of 14 pairs of gastric cancer (GC),10 pairs both primary gastric cancer and adjacent normal tissue could express SM22 mRNA,but the expression of SM22 mRNA was significantly higher than the expression in normal tissues,4 pairs SM22 mRNA were only expressed in gastric cancer tissue and was negative in matched normal tissues.Conclusion  The expression of SM22 mRNA was significantly higher in gastric cancer than in controlled normal tissue,which suggests SM22 play an role in carcinogenesis and development of gastric cancer.

    【Key words】  SM22;gastric cancer;RT-PCR

    胃癌是世界范围内发病率较高的肿瘤之一,我国属于胃癌高发地区[1]。已有研究表明[2,3],胃癌的发生、发展是多因素、多基因变异累积的复杂病变过程。到目前为止,对胃癌最终形成的分子病理学改变仍不是十分清楚。分离鉴定与胃癌发生、发展有关的分子与基因,寻找胃癌组织与正常胃黏膜的差异,分子标志物对阐明胃癌的发生、发展机制,及对胃癌的预防、诊断与综合治疗都有重要意义。Klade CS等人[4]研究发现SM22蛋白在胃癌中表达上调,有关SM22基因与胃癌发生、发展之间的关系国内外尚未见相关报道。本研究利用RT-PCR技术检测SM22基因在胃癌及正常对照组织中的表达差异。

    1  资料与方法

    1.1  标本来源  胃癌及正常组织标本均取自2002年9月~2003年7月内蒙古医学院附属医院、内蒙古医院和北京大学附属肿瘤医院胃癌手术切除患者。男35例,女7例;平均(53.67±17.59)岁。标本在手术切除后1h内获得,所有标本均经过临床病理验证,腺癌38例,鳞癌4例。其中配对胃癌组织14例,胃正常组织取自距相应胃癌病灶5cm以上胃黏膜,未配对胃癌组织标本28例。标本在获得后立即放入液氮或-80℃低温冰柜中保存。

    1.2  引物的设计与合成  根据SM22基因cDNA核酸序列设计引物,SM22,上游引物:5 ′―TGG TGA ACA GCC TGT ACC CT―3′,下游引物5′―CAC GGT AGT GCC CAT CAT TC―3′,扩增产物片段长度为235bp。以GAPDH为内对照,上游引物:5′―ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC―3′,下游引物:5′―TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA―3′,扩增产物片段长度为472bp。所有引物均由北京奥科生物技术公司合成。

    1.3  酸性酚―异硫氰酸胍法制备总RNA  0.5g匀浆研碎的组织加2.5ml裂解液,将裂解液倒入10ml离心管中,冰浴10min。加入0.2M醋酸钠/0.1mM ATA  0.25ml,强烈振混,30s×2次。加ATA饱和的酚2.75ml,强烈振混,30s×2次。加24∶1氯仿:异戊醇0.55ml,强烈振混,30s×2次。冰浴15min后,于4℃,10000rpm离心20min。取上清,加1.1ml异丙醇-20℃冰箱沉淀1h。4℃,10000rpm离心20min。弃上清,将沉淀溶于RNA变性液150μl中。加15μl 3M醋酸钠,330μl无水乙醇-20℃冰箱沉淀1h后保存备用。产物用紫外分光光度计测量RNA纯度A260/A280在1.8~2.2之间。

    1.4  RT-PCR及PCR  mRNA逆转录成cDNA(第一链的合成)5μg总RNA 4℃ 12000rpm离心25min,弃上清,洗盐后加入0.2μl/管,用DEPC・H2O稀释成20μl后,70℃变性10min,迅速插冰冷却。加入5×RT缓冲液6μl,dNTP 2μl,Rnasin 0.5μl,混匀,加入M-MLVE 1μl,37℃孵育1h,70℃15min终止反应,-20℃保存备用。PCR反应体系采用20μl PCR反应体系,PCR循环参数:95℃充分变性2min30s;94℃变性30s,56℃退火30s,72℃延伸30s,33个循环;循环反应结束后,72℃充分延伸10min;4℃保存。以GAPDH为内对照,每次PCR反应均设阴性、阳性对照。

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