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非接触式共培养技术在体外细胞实验中的初步应用

2017-10-03 22:00:05    作者:admin    www.5alw.com
                   作者:赵学铭,刘易欣,倪春生,赵秀兰,孙 涛,古强,孙保存

【关键词】  ,间充质干细胞;恶性黑色素瘤;非接触式共培养,

    [摘要]  目的  研究与恶性黑色素瘤细胞进行非接触式共培养的间充质干细胞表型变化,从而明确非接触式共培养体系可以应用于两种细胞之间相互作用的研究。
   
    方法  利用Transwell进行非接触式共培养,分析间充质干细胞形态变化,利用免疫组织化学与免疫荧光检测其Ⅷ因子和CD34表达。
   
    结果  间充质干细胞在非接触式共培养体系中可以被恶性黑色素瘤细胞诱导为多角形或短梭形,同时Ⅷ因子和CD34表达上调。
   
    结论  初步表明与恶性黑色素瘤细胞非接触式共培养的间充质干细胞中部分细胞表型发生改变,明确非接触式共培养体系可以应用于MSC和恶性黑色素瘤细胞之间相互作用的研究。
   
    [关键词]  间充质干细胞;恶性黑色素瘤;非接触式共培养   
      
    Primary application of in vitro cell research by indirect coculture system
    
      
    [Abstract]  Objective  To study the phenotype change and interactions of mouse bone marrowderived mesenchymal stem cells induced by B16, a mouse malignant melanoma cell line.
   
    Methods  Indirect coculture was based on transwell system to analyse the phenotype change of MSC. Determination of the expression of  Ⅷ factors and CD34 by immunohistochemistry and immunofluorescence.
   
    Results  MSC was form in polygon and fusiform induced by B16. Then the immunohistochemistry and immunofluorescence staining show Ⅷ factors and CD34 was upregulation of MSC.
   
    Conclusion  The results of the indirect coculture experiments with B16 cell and MSC in vitro can initially confirm that parts of the MSC transform their phenotype, it means that indirect coculture system may used in cell interaction research in vitro.
   
    [Key words]  mesenchymal stem cells; malignant melanoma; indirect cocuuture      
   
    间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSC)是指存在于骨髓基质中的非造血组织的另一类重要的干细胞,它最显著的生物学特征是既有自我更新的能力,又具有向多种中胚层和神经外胚层来源的组织细胞分化的潜能[1,2]。它有着广泛的来源,包括骨髓、骨骼肌、软骨、骨、肌腱等,故在干细胞研究领域中具有突出的优势及非常重要的理论研究意义和临床应用价值。
   
    笔者希望通过进行MSC细胞和恶性黑色素瘤细胞的非接触式共培养,观察不同培养条件下的MSC形态,检测多种指标免疫组织化学染色结果、分析差异,初步表明与恶性黑色素瘤细胞非接触式共培养的MSC中部分细胞表型发生改变,明确非接触式共培养体系可以应用于MSC和恶性黑色素瘤细胞之间相互作用的研究。
   
    1  材料与方法
   
    1.1  实验动物  小鼠源性间充质干细胞,天津医科大学病理教研室。小鼠源性恶性黑色素瘤细胞B16细胞系,环湖医院细胞室。
   
    1.2  主要实验试剂  CD34,兔抗小鼠IgG多克隆抗体,Santa cruz公司,货号SC-9095。Ⅷ因子,兔抗小鼠IgG多克隆抗体,基因公司,货号GA008202。
   
    1.3  主要实验器材  倒置相差光学显微镜,Olympus公司。图像采集系统,Nikon/Dell公司。自动控制恒温培养箱,Jouan公司。Transwell,0.4 μm孔径,Costar公司。
   
    1.4  非接触式共培养体系中B16细胞对MSC细胞的诱导分化作用
   
    1.4.1  MSC细胞与B16细胞非接触式共培养实验  选取MSC细胞和B16细胞,进行细胞计数,配制成浓度为3.0×104个/ml的MSC预培养工作液和浓度为7.5×104个/ml的B16预培养工作液。将1 ml MSC预培养工作液加入对应的Transwell预培养孔中;将0.1 mlB16预培养工作液加入Transwell中的共培养插件中,再将0.6 ml培养基,沿侧壁缓缓注入下层小室,样品编号,预培养24 h后,取出Transwell培养板,将各孔及共培养插件中原有的培养液吸去,向MSC预培养孔中加入0.6 ml培养基(10%胎牛血清+约90%α-MEM+2%双抗),将装载有B16细胞的共培养插件一一对应放入MSC预培养孔中,向每个共培养插件中缓缓加入0.1 ml10%血清的培养基,完成Transwell非接触式共培养体系的装配。放入恒温孵育箱中,72 h非接触式共培养,定期观察细胞生长情况。
   
    非接触式共培养72 h后,吸净Transwell中的培养基,去除各孔中的共培养插件,PBS清洗2次,向各孔中加入4%的多聚甲醛,固定30 min,做好标记,放入-20 ℃保存,作为留取的非接触式共培养组MSC细胞免疫组织化学检测样本。
   
    1.4.2  MSC细胞对照性单独培养实验  选取MSC细胞,进行细胞计数,配制成浓度为3.0×104个/ml的对照培养MSC工作液。将1 ml单独对照培养MSC工作液加入相应的Transwell预培养孔中,样品编号,预培养24 h后,取出将Transwell培养板,将各孔及共培养插件中原有的培养液吸去,向各孔中加入1 ml培养基。放入恒温孵育箱中培养,72 h单独对照培养,定期观察细胞生长情况。
   
    单独对照培养72 h后,吸净Transwell中的培养基,PBS清洗2次,向各孔中加入4%的多聚甲醛,固定30 min,做好标记,放入-20 ℃保存,作为留取的单独对照培养MSC细胞免疫组织化学检测样本。
   
    1.4.3  非接触式共培养实验中MSC表面分子标记物的免疫组织化学检测  进行共培养和单独对照培养组中小鼠骨髓间充质干细胞的CD34和Ⅷ因子指标免疫组织化学检测。观察各孔的显色情况,光学倒置显微镜观察,并进行图像采集。实验数据以每种指标的平均阳性细胞数和平均阳性率表示。每组数值经过标准化后,应用χ2检验方法对各组间差异进行比较。

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