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升清胶囊对豚鼠胆石病相关基因的影响

2017-10-05 04:00:09    作者:admin    www.5alw.com

【关键词】  ,,胆结石

    [摘要]  目的:探讨中药升清胶囊在分子层面防治胆石病的机制。方法:雌性豚鼠60只,随机分成正常组(喂正常饮食作为对照)、模型组(喂低蛋白饮食致石)和中药组(喂低蛋白饮食致石加中药升清胶囊治疗)。6周后处死并取材,观察动物成石情况,检测肝组织胆红素尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶(bilirubin UDPglucuronosyltransferase, BUGT)mRNA及胆固醇7α羟化酶(cholesterol 7αhydroxylase, CYP7A1)mRNA表达。结果:各组豚鼠成石比例分别为正常组2/14、模型组为9/11、中药组为4/14,组间有显著差异(P<0.05),正常组和中药组豚鼠的肝组织BUGT mRNA及CYP7A1 mRNA表达明显高于模型组(P<0.05)。结论:中药升清胶囊可能是通过上调肝组织中BUGT mRNA和CYP7A1 mRNA的表达,干预胆红素和胆固醇代谢,抑制致石性胆汁形成,起到预防胆结石的作用。

    [关键词]  胆结石; 升清胶囊; BUGT; 胆固醇7α羟化酶; 基因

      Effects of Shengqing Capsules on cholelithiasisrelated genes in guinea pigs

      ABSTRACT  Objective: To explore the molecular mechanisms of Shengqing Capsules in treating cholelithiasis. Methods: Sixty female guinea pigs were randomized into 3 groups: group Ⅰ (fed with normal diet), group Ⅱ (fed with lowprotein diet) and group Ⅲ (fed with lowprotein diet and Shengqing Capsules). After sixweek feeding, the gallstone formation and the expressions of bilirubin UDPglucuronosyltransferase (BUGT) mRNA and cholesterol 7αhydroxylase (CYP7A1) mRNA were observed. Results: The proportions of stoneformed in groups Ⅰ, Ⅱ and Ⅲ were 2/14, 9/12 and 4/14, respectively. There were significant differences among the three groups (P<0.05). The expressions of BUGT and CYP7A1 mRNAs were higher in both group Ⅰ and group Ⅲ as compared with those in the group Ⅱ (P<0.05). Conclusion: Shengqing Capsules can reduce the rate of stoneformation, which may be due to its interference of metabolism of bilirubin and cholesterol and upregulation of the expressions of BUGT and CYP7A1 mRNAs.

    KEY WORDS  cholelithiasis; Shengqing Capsules; BUGT; cholesterol 7αhdroxylase; gene

     胆石病属中医“胁痛”、“黄疸”等范畴,历代医家积累了丰富的治疗经验。作者曾在已故外科专家顾伯华教授和徐长生教授采用疏肝利胆法治疗本病取得较好疗效的经验基础上,总结和开发了治疗肝胆气郁型胆石病的中成药胆宁片。近年,作者又从小复方角度进一步精简胆宁片的药味,研制开发出治疗胆石病的新一代中成药升清胶囊,并在此前的研究中发现该药能从胆石病发病的枢纽环节肝细胞水平阻断致石性病理性胆汁的形成,显著降低实验动物胆色素结石的成石率[1]。为进一步探讨升清胶囊在分子层面防治胆石病的机制,开展了以下研究。

    1  材料与方法

    1.1  实验材料

    1.1.1  实验动物  红目雌性豚鼠,清洁级,共60只,体质量250~300 g,由上海中医药大学实验动物中心提供。

    1.1.2  药物  升清胶囊,主要药物组成为大黄、虎杖和陈皮,上海中医药大学龙华医院制剂室提供干粉剂。

    1.1.3  饲料  正常饲料,由上海申旺实验动物中心提供。造模用致石性饲料,在正常饲料基础上添加致石药物。具体配方为:正常饲料45.43 g,致石性药物4.57 g(其中酪蛋白1 g、蔗糖1.5 g、猪油1 g、微晶纤维素1 g、胆酸0.02 g、胆固醇0.05 g)。

    1.1.4  主要试剂  焦碳酸二乙酯(DEPC),脱氧核苷三磷酸(10 mmol/L),随机引物(100 μmol/L),博彩生物技术公司产品;RNA提取试剂Trizol,Taq聚合酶(5 U/μl),Gibco公司产品;MMuLV逆转录酶(200 U/μl),核糖核酸酶抑制剂(RNAsin,40 U/μl),Promaga公司产品;DNA标记物(100 bp),生工生物技术公司产品。豚鼠胆红素尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶(bilirubin UDPglucuronosyltransferase, BUGT)上游引物(270289, 20 bp): 5’ACT GGG CAA CGC TAA GAA GG3’;下游引物(531512, 20 bp): 5’TAT GCC ACA GGG AAC AGA GC3’;PCR产物长度:262 bp。豚鼠胆固醇7α羟化酶(cholesterol 7αhydroxylase, CYP7A1)上游引物(812832, 21 bp): 5’GTT TCT CAA TGA CAC GCT CTC3’;下游引物(12491229, 21 bp): 5’AAA GTC AAA GGG TCT GGG TAG3’;PCR产物长度: 438 bp。豚鼠内参βactin上游引物(30 bp): 5’TCA TGA AGT GTG ACG TTG ACA TCC GTA AAG3’;下游引物(30 bp):5’GCT AGA AGC ATT TGC GGT GCT CGA TGG AGG3’;PCR产物长度:286 bp。

    1.1.5  主要仪器  -85 ℃/371 L ELTBLV超低温冰箱,美国Harris公司;AA200DS电子天平,美国G&G公司;匀浆器,美国Wheaton公司;低温离心机,日本久保田公司;平面电泳仪,LKB激光灰度扫描仪,瑞典Pharmacia公司;LNGT83真空离心浓缩干燥器,太仓市华美生化仪器厂;DZF3型干燥箱,上海顿克仪器科技有限公司;DSHZ300型多用途水浴恒温振动器,上海一恒科技有限 公司;X700型照相机,日本美能达公司;紫外线透射反射仪,北京利康达圣科技发展有限公司;752分光光度计,上海测维光电技术有限责任公司;DNA Amp Cycler 9600 PCR热循环仪,9600型PCR基因扩增仪,KS400型计算机图像分析系统,美国PerkinElmer公司。

    1.2  实验方法

    1.2.1  造模方法  采用本科室首创的低蛋白致石饮食所致的豚鼠胆结石模型[1]。将豚鼠置实验室笼养,每笼5只,先喂养正常饲料1周以适应环境,造模时喂以致石性饲料,造模期间不限饮食量,自由饮水,控制青菜量。

    1.2.2  动物分组  将60只豚鼠随机分为3组,即正常对照组(正常组)15只、致石饲料造模组(模型组)25只、致石饲料造模并经中药升清胶囊治疗组(中药组)20只。正常组喂以正常饲料及适量青菜;模型组喂以致石饲料及少量青菜(相当于正常组的1/10);中药组在喂以致石饲料及相当于模型组青菜量的同时,加喂中药升清胶囊,其中正常饲料和致石饲料均不限量。

    1.2.3  给药方法  先将升清胶囊干粉剂按89 mg/ml浓度配制成干粉溶液。中药组按10 ml・kg1・d1喂以升清胶囊干粉溶液。模型组及正常组灌以生理盐水,按10 ml・kg1・d1灌胃。均分2次灌胃,连续6周。

    1.2.4  标本采集  用15%乌拉坦以1 g/kg剂量腹腔注射麻醉,新洁尔灭酊消毒皮肤后,打开腹腔,抽取后腔静脉血,止血钳钳夹胆囊管,肉眼观察成石情况,用1 ml皮试针筒抽取胆汁后充氮,-20 ℃避光保存(供生化检测,另文报道),完整切除胆囊,剖开,再仔细观察成石情况。取相同部位肝组织约1 cm×1 cm×1 cm,用10%福尔马林固定作光镜检查。从各组中每组随机抽取5只,切取2 mm×2 mm×2 mm肝组织,用2%戊二醛固定,待作电镜观察(另文报道)。其余肝组织置液氮中保存。

    1.3  观察指标

    1.3.1  大体情况及体质量变化  观察各组动物饮食、体质量变化、皮毛光泽度、活动情况及成活率等。

    1.3.2  胆囊成石率  拨开胆囊,以肉眼观察胆囊内有无胆石或胆泥作为判断动物结石的标准,记录各组动物成石情况。

    1.3.3  肝组织胆石病相关基因BUGT及CYP7A1 mRNA表达  依据博彩生物技术公司提供的操作说明,配制相关的实验工作液,并完成组织总RNA抽提、RT反应、PCR、电泳等步骤。随后用KS400型图像分析系统对电泳凝胶的底片进行光密度扫描,以目的基因光密度值与对应样品内参基因光密度值的比值作为该样品中目的基因的相对转录量,最后以目的基因的相对转录量为参数进行统计分析。

    1.4  统计学方法  用SPSS 10.0进行单因素方差分析,计数资料按Ridit法计算u值。

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