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枸杞多糖对荷瘤小鼠肿瘤微环境T淋巴细胞亚群及树突状细胞的影响

2017-10-05 06:00:11    作者:admin    www.5alw.com

              作者:何彦丽,应逸,许艳丽,苏俊芳,罗惠,王惠峰

【关键词】  枸杞多糖

    [摘要]目的:研究枸杞多糖(Lycium barbarum polysaccharide, LBP)对荷瘤小鼠体内肿瘤微环境中T淋巴细胞亚群和树突状细胞(dendritic cells, DCs)的影响,探讨LBP对荷瘤机体免疫逃逸的干预作用。方法:用LBP给H22荷瘤小鼠灌胃,连续2周后,测定肿瘤重量,采用流式细胞术检查肿瘤浸润淋巴细胞(tumorinfiltrating lymphocyte, TIL)中T淋巴细胞亚群和DCs的数量,以及协同刺激分子CD80(B71)表达的变化。结果:LBP可明显抑制肿瘤细胞的生长,增加肿瘤浸润CD4+、CD8+细胞的数量。LBP高剂量组CD4+和CD8+细胞数量的百分比高于模型组(P<0.05)。LBP低剂量和高剂量组肿瘤浸润DCs数量及B71表达均较模型组升高,但差异无统计学意义。结论:LBP的抗肿瘤作用可能与恢复荷瘤小鼠TIL中CD4+、CD8+的细胞数量、解除机体的免疫抑制状态及增强机体的抗肿瘤免疫功能有关。LBP能否恢复荷瘤机体DCs的表型及功能尚待进一步研究。
  
  [关键词]枸杞多糖; 免疫抑制; 淋巴细胞亚群; 肿瘤浸润淋巴细胞; 树突状细胞

  Effects of Lycium barbarum polysaccharide on tumor microenvironment Tlymphocyte subsets and dendritic cells in H22bearing mice

  ABSTRACT  Objective: To study the effects of Lycium barbarum polysaccharide (LBP) on tumor microenvironment Tlymphocyte subsets and dendritic cells in H22bearing mice and the mechanisms for intervention of tumor immune escape by LBP. Methods: H22bearing mice were given LBP orally for two weeks. Tlymphocyte subsets and the phenotypes of dendritic cells in tumorinfiltrating lymphocytes (TIL) were detected by flow cytometry (FCM). Results: LBP could significantly increase the numbers of CD4+ and CD8+ T cells in TIL as compared with those in model control group (P<0.05). In model control group, the number of dendritic cells in tumor microenvironment decreased markedly, while in LBPtreated group, the increased number of dendritic cells and B71 expression were observed, but there were no significant differences between these two groups. Conclusion: LBP has antitumor effect probably by increasing the numbers of CD4+and CD8+ T cells in TIL to relieve the immunosuppression and enhance the antitumor function of the immune system. But whether LBP can recover the phenocyte and function of dendritic cells in H22bearing mice should be further studied.

  KEY WORDS  Lycium barbarum polysaccharide; immunosuppression; Tlymphocyte subsets; tumorinfiltrating lymphocyte; dendritic cells

  近年来的研究发现:肿瘤患者体内存在多种免疫逃逸机制,表现为CD4+和CD8+ T淋巴细胞数量减少,CD4+/CD8+比值改变及肿瘤间质中的树突状细胞(dendritic cells, DCs)表型异常,这些都是导致恶性肿瘤细胞逃逸机体免疫监视从而造成肿瘤持续生长并发生转移的原因[1,2]。已有研究证实:枸杞多糖(Lycium barbarum polysaccharide, LBP)具有明显的免疫调节和免疫保护功能,可以增强机体的抗肿瘤作用[3,4]。但LBP抗肿瘤的作用机制究竟为何?是否与其影响免疫活性细胞的功能有关?如何从免疫逃逸的角度探讨LBP的抗肿瘤作用机制?有关这方面的研究却鲜见报道。本实验以H22肝癌腹水瘤荷瘤小鼠为模型,研究LBP在全身给药情况下,对肿瘤微环境中T淋巴细胞亚群及DCs的影响,从免疫逃逸的角度揭示LBP抗肿瘤作用的机制。

  1材料与方法

  1.1材料  昆明种小鼠,清洁级,6~8周龄,体质量(18±2)g,雌雄各半,广州中医药大学动物中心提供,动物质量合格证号0002769;H22肝癌腹水型细胞株,中山大学医学院动物中心细胞库提供;LBP,由广州中医药大学药物化学研究所自宁夏枸杞子中提取,呈棕黄色粉末,纯度≥35%;Ⅳ型胶原酶和Ⅰ型DNase酶,均为Sigma公司产品;淋巴细胞分离液,广州展晨生物科技有限公司产品;异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)标记的抗小鼠CD4、CD80(B71)单克隆抗体,藻红蛋白(phycoerythrin, PE)标记的抗小鼠CD8a、CD11c单克隆抗体,美国BioLegend公司产品;电子天平,日本岛津公司产品;FACS Vantage流式细胞仪,美国Becton Dickinson公司产品。

  1.2实验动物及分组  昆明种小鼠60只,随机分成4组:正常组、模型组、LBP低剂量组和LBP高剂量组,每组15只。其中后3个组,第1天右侧腋下接种2×106个H22肿瘤细胞。第3天起,前2个组小鼠予以生理盐水灌胃,0.5 ml/d;后2个组LBP给药剂量根据文献[5]结合预试验结果,分别给予LBP 0.625 g・kg1・d1及1.25 g・kg1・d1灌胃(均用生理盐水稀释成0.5 ml/d),连续灌胃14 d。

  1.3LBP体内抑瘤率的测定 每日观察并记录小鼠生长情况及肿瘤大小,第15天小鼠眼球放血后予以脱颈处死,解剖并观察肿瘤大小及重量,计算肿瘤生长抑制率:局部肿瘤的生长抑制率=(模型组平均瘤重-LBP组平均瘤重)/模型组平均瘤重×100%。所有动物均摘取胸腺称重,计算胸腺指数(胸腺指数=小鼠胸腺质量/体质量)。

  1.4肿瘤间质淋巴细胞的分离  肿瘤组织称重后,挑选瘤体质量≥2 g者置于含青霉素和链霉素各500 U/ml、甲硝唑5 μg/ml的RPMI1640培养液中浸泡30 min后,将瘤体剪成1 mm3大小,置于含0.05% Ⅳ型胶原酶、0.003% Ⅰ型DNase酶及10%小牛血清的RPMI1640培养液中,4 ℃磁力搅拌过夜消化,200目消毒铜网过滤洗涤后,1 500 r/min离心15 min,分离获得肿瘤浸润淋巴细胞(tumorinfiltrating lymphocyte, TIL),用DHanks液洗涤2次,台盼蓝染色检测细胞活力,调整细胞浓度至1×106/ml。

  1.5TIL中CD4、CD8a、CD11c、CD80流式细胞仪分析  每个样本分3管,每管中加入3×105个细胞,PBS液调整总体积为100 μl,其中第1管中加入不同荧光素标记的抗鼠CD4、CD8a单克隆抗体0.5 μl(0.25 μg)、1.0 μl(0.2 μg),第2管中加入不同荧光素标记的抗鼠CD11c、CD80单克隆抗体1.0 μl(0.2 μg)、1.0 μl(0.5 μg),第3管为空白对照管,室温避光孵育30 min,PBS液洗涤2次,每次实验取2管细胞分别加入FITC和PE单荧光素标记抗体,用流式细胞仪检测。

  1.6统计学方法  所有实验数据均采用SPSS 11.5软件进行统计学分析,行单因素方差分析及组间比较最小显著差(least significant difference, LSD)法。

  2结果

  2.1LBP对H22荷瘤小鼠肿瘤生长及胸腺指数的影响  模型组平均瘤体质量(2.48±0.40)g,LBP低剂量组和高剂量组分别为(1.89±0.29)g和(1.46±0.26)g,其中,LBP高剂量组与模型组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。LBP低剂量组和高剂量组的肿瘤生长抑制率分别为23.79%和41.12%。模型组荷瘤小鼠的胸腺质量较正常组轻,LBP组荷瘤小鼠的胸腺质量及胸腺指数则有所恢复。见表1。

  表1  LBP对H22荷瘤小鼠胸腺指数的影响(略)

  Tab 1  Effect of LBP on thymus index in H22bearing mice

  *P<0.05, vs model control group

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