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核糖体S6激酶对肝星状细胞内胶原表达的调控

2018-05-07 12:00:02    作者:admin    www.5alw.com

                  作者:杨妙芳,许小兵,吴文娟,张晓华,朱人敏 

【摘要】  目的: 探讨核糖体S6激酶(p90RSK)调节肝星状细胞(HSC)Ⅰ型胶原表达的作用. 方法: 将设计的p90RSK特异性siRNA克隆至真核表达载体pAV?U6+27中,构建p90RSK的RNA干扰真核表达载体pAV?RSKi. 将构建的pAV?RSKi通过脂质体瞬时转染HSC?T6,分别采用实时定量聚合酶链式反应和Western Blot方法检测细胞的p90RSK和Ⅰ型胶原mRNA和蛋白表达. 将p90RSK的真核表达质粒(pMT2?RSK1)和pAV?RSKi分别与Ⅰ型胶原启动子荧光素酶报告基因质粒(pGL3?COL1A1)共转染原代HSC,48 h后检测细胞的荧光素酶活性. 结果: 构建的pAV?RSKi能够有效抑制HSC?T6中p90RSK mRNA和蛋白表达,与对照组相比较分别减少了(70.20±4.04)%和(89.10±5.26)%(P<0.01). HSC?T6中Ⅰ型胶原的mRNA和蛋白的表达,与对照组相比较分别减少(61.80±3.96)%和(98.50±7.01)%(P<0.01). 各组转染pMT2?RSK1,pAV?RSKi和空载质粒的HSC中,Ⅰ型胶原启动子活性之间的差异无统计学意义(P>0.05). 结论: p90RSK参与了HSC中胶原的表达调控,可能成为肝纤维治疗的新靶点.

【关键词】  核糖体蛋白质S6激酶类;肝/细胞学;星形细胞;胶原Ⅰ型;RNA干扰

     0引言

    核糖体S6激酶(90?KDa ribosomal S6 kinase, p90RSK)隶属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族,是细胞外信号调节激酶(extracellular signal?regulated kinase 1 and 2, ERK1/2)信号转导通路的重要效应分子,具有在多种细胞内调控基因转录、细胞周期以及维持细胞生存等生物活性[1-2],在肿瘤的发生及神经系统发育中具有重要的调控作用[3]. 活化的肝星状细胞(hepatic stellate cell, HSC)是肝纤维化时细胞外基质的主要来源和发生、发展的中心环节[4]. 研究[5-6]表明p90RSK在肝纤维化中表达增加,并参与诱导HSC的凋亡. 然而p90RSK是否参与调节HSC内胶原的表达及其可能机制,目前国内外尚少见报道. 本实验采用RNA干扰、报告基因等技术,研究HSC内p90RSK调节胶原表达及其分子机制,为临床治疗肝纤维化提供新的思路.

    1材料和方法

    1.1材料雄性SD大鼠250~300 g(南京军区南京总医院实验动物中心);pMT2?RSK1由美国哈佛大学医学院Avruch教授惠赠. pAV?U6+27由美国密歇根大学生物化学实验室Engelke教授惠赠. 携带大鼠Ⅰ型胶原启动子及萤火虫荧光素酶基因的pGL3?COL1A1由东南大学实验中心提供. 肝星状细胞株HSC?T6由美国西奈山大学肝脏中心实验室Friedman教授惠赠,其表型为活化的HSC. 小鼠抗大鼠RSK抗体(美国BD 公司);兔抗大鼠Ⅰ型胶原抗体(武汉博士德公司);荧光素酶检测试剂盒(美国Promega公司);CK40型电转化仪,iCyclerTM 光学荧光定量PCR仪,PAC3000蛋白电泳仪,半干转膜仪(美国BIO?RAD公司);CK40倒置显微镜(日本Olympus公司);聚偏二氧乙烯膜(PVDF)(美国Schleicher & Schuell公司);LipofectamineTM2000试剂(美国Invitrogen公司);牛血清白蛋白(美国Sigma公司).

    1.2方法

    1.2.1HSC原代细胞的分离培养大鼠称重后以戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔注射麻醉后,以10 U/L肝素钠1 mL/kg将大鼠肝素化,暴露门静脉,插管,以37℃无钙灌流液预灌流,40~50 mL/min,持续约10 min;其后用酶灌流液继续灌流,40~50 mL/min,持续时间为10~15 min. 取出肝脏,剪碎、消化、过滤,滤液离心,1700 r/min,离心7 min,弃上清,用D?Hanks清洗,1700 r/min,离心7 min;弃上清,沉淀以1∶2体积的180 g/L的Nycodenz混匀,行密度梯度离心,3400 r/min,离心17 min;取界面处细胞,用DMEM清洗2次,1700 r/min,离心7 min;取沉淀细胞悬浮于含200 mL/L小牛血清的DMEM中,用台盼蓝染色判断存活率;将细胞以1×105/cm2接种于培养皿,置37℃,50 mL/L CO2培养箱培养,24 h细胞贴壁后换液;倒置显微镜下观察所分离的HSC形态和培养后的形态变化;在荧光显微镜328 nm波长的紫外光激发下,观察HSC的自发荧光.

    1.2.2RNAi载体的构建及鉴定通过网站的siRNA设计软件,设计针对大鼠p90RSK的特异性siRNA:Forward oligo:TCGACAAAAGAGATCCCTCCGAAGTTCGCTTCGGAGGGAT

    CTCTTTTTTTT;Reverse oligo:CTAGAAAAAAAAGTAGATCCCTCCGAAGCGAACTTCGGAGGGATCTCTTT

    TG ,由上海申友生物工程公司合成. 将合成的片段分别溶于双蒸水中,配制成100 pmol/L的溶液,将引物进行退火、磷酸化. pAV?U6+27空载质粒进行酶切线性化,并将酶切产物纯化后与合成的引物于16℃连接过夜后感受态细菌(DH5α)转化,构建p90RSK的特异性质粒pAV?RSKi,质粒抽提、酶切鉴定.

    1.2.3HSC细胞转染应用LipofectamineTM2000试剂进行pAV?RSKi瞬时转染HSC?T6细胞株(表型为活化状态的HSC),以pAVU6+27空载体作为对照. 转染当日,在1.5 mL离心管中以250 μL无血清、无抗生素的 DMEM培养液稀释4 μg目的质粒,充分混匀. 同时,在另一1.5 mL离心管中以250 μL无血清、无抗生素的DMEM培养液稀释10 μL脂质体,并于5 min内将其与DNA稀释液混合. DNA?脂质体混合物在室温下放置30~45 min. 在此期间,以新鲜DMEM培液(含有血清但无抗生素)洗涤细胞2次,然后加入1 mL相同培液. 将500 μL DNA?脂质体混合物加入6孔培养板中,前后摇动,使其充分混匀,放置于37℃,50 mL/L CO2培养箱中培养. 在质粒转染12 h后加入等体积新鲜含血清培养基,转染24~48 h后收集细胞进行目的基因的实时定量PCR和Western Blot检测.

    共转染:在进行报告基因检测中,采用原代分离培养的HSC细胞. 各组细胞分别转染p90RSK的表达质粒(pMT2?RSK1,1 μg),RNA干扰质粒(pAV?RSKi, 1 μg),pGL3?basic(1 μg,基础对照),pGL3?control(1 μg,阳性对照)外,均再加入pGL3?COL1A1(1 μg)和pRLSV40(0.1 μg,为内参)共转染,24 h后,弃去转染液,加入正常细胞培养液,继续孵育至48 h,进行荧光素酶活性检测.

    1.2.4实时定量PCR检测p90RSK和胶原mRNA的表达提取转染组和对照组细胞总RNA,逆转录合成cDNA模板,进行目的基因的PCR扩增,产物10-1倍比稀释,制备标准曲线样品. 采用荧光定量RCP仪分别扩增目的基因和内参基因,测定标准曲线和熔解曲线,用Ct值表示样品中模板的相对含量. 荧光定量RCP的反应体系与条件:25 μL反应体系,正、负引物(10 μmol/L)各0.5 μL,Takara 2×PCR Master mix 12.5 μL,模板1.0 μL,加水补足. 预变性94℃ 2 min,94℃ 15 s,60℃ 20 s,72℃ 20 min,共40个循环. 产物熔解曲线测定条件为:95℃ 1 min,72℃ 1 min,每升高0.5℃保持30 s,至95℃. RT?PCR使用的正向引物(F)和反向引物(R)包括:p90RSK(F)TCTCTGTCCAGCGGCGGGTGAGGA;p90RSK(R)GCATTCACAGCGCCCATGCGCAG;CollagenⅠ(F)CCAGCCGCAAAGAGTCTACATGTC;Collagen Ⅰ(R)ITCACCTTCTCATCCCTCCTAA;18 sRNA(F)GTCTGTGATGCCCTTAGATG;18sRNA(R)AGCTTATGACCCGCACTTAC.

    1.2.5Western Blot检测p90RSK和胶原蛋白的表达吸去细胞培养液,1×PBS(0.01 mol/L, pH7.4)洗涤后加入裂解液[(10 mmol/L Tris(pH7.5~8.0), 25 mol/L NaCl, 10 mL/L Triton?X?100, 10 g/L Protease inhibitor)]冰上放置20 min后收集裂解液,4℃,13 000 g,离心30 min,收取上清,进行福林?酚法蛋白定量. 取20 μg蛋白样品行聚丙烯酰胺凝胶(50 g/L沉积胶,100 g/L分离胶)电泳分离样品,转印至PVDF膜. 50 mL/L牛血清白蛋白,4℃封闭过夜后,一抗(1∶1000稀释)室温孵育3 h,PBST充分洗涤后加入二抗(1∶5000稀释)室温孵育2 h,PBST充分洗涤,鲁米诺和增强子(ECL plus)室温孵育2 min后Kodak增感胶片曝光检测. 以β?actin为内参照.

    1.2.6荧光素酶报告基因活性检测转染48 h后,以PBS洗涤细胞2次,每孔细胞加入1×reporter lysis,离心收集上清,取20 mL上清按照检测试剂说明书操作,用化学发光检测仪检测荧光素酶的活性.

    统计学处理:采用SPSS11.0统计软件进行方差分析,数据以x±s表示. P<0.05为差异有统计学意义.

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