原生质体融合是比较传统、效果较好且应用较多的一种育种方法。Kordowska等将毕赤氏酵母和酿酒酵母进行原生质体融合，得到的融合子耐酒精性能高于亲本毕赤氏酵母，但融合子发酵木糖产生乙醇的速率小于毕赤氏酵母[15]。此外，韩丽丽等对季也蒙毕赤酵母和休哈塔假丝酵母采用PEG融合技术和电击融合得到1株休哈塔假丝酵母种内融合的菌株XX2；并进一步通过EMS与LiCl复合诱变、紫外照射与Licl复合诱变、紫外、EMS及Licl复合诱变得到4株以X为出发菌的高效产乙醇菌株X1、X4、X12、X13。其乙醇产量分别提高了37.7％、30.9％、15.7％、84.9％、47.1％[16]。
　　诱变育种也是较为常用的方法。刘天霞等对嗜单宁管囊酵母菌株g-13进行紫外诱变，得到的菌株在适宜条件下发酵，酒精浓度可达7.7g/L，比出发菌株酒精浓度提高了12%【17】。而陈叶福等以C．shehataeCICC1766为出发菌株进行紫外诱变处理，并结合氮离子注入诱变，筛选得到高产诱变菌株SY24、SY43、SY58、SY126，乙醇产量比出发菌株C．shehataeCICC1766提高了21.98%，乙醇得率为0.418g/g，达到理论得率的90.8%。诱变后得到的高产菌株SY58进行5L罐木糖发酵试验，最终乙醇浓度25.04g/L，得率为0.417g/g，达到理论产量的90.7%，同摇瓶发酵结果基本相同，并且发酵周期缩短至52h[18]。可见，不同方法的有效结合，比单一的紫外诱变效果更好。
　　2.3基因工程技术育种
　　由木糖的代谢途径可知：木糖代谢途径较长，氧化还原反应复杂，且需要多种酶。现发现的菌种或是因为没有相应的酶，或是因为不能提供合理的辅酶，导致代谢途径不能顺利且高效的向下游进行，产生大量的副产物，降低了木糖利用率和目标产物的产率。人们便通过基因工程手段将代谢途径中需要的关键酶的基因克隆表达到目的菌株中，以期使代谢流向顺畅高效且能耐受高糖浓度、高乙醇浓度、耐发酵抑制物等不利因素。主要可以从两方面入手：一是改造已有菌种，克隆表达酶基因并增加新的底物利用能力；二是选择原本不具备发酵木糖能力，但易于基因改造的菌株，导入关键的酶基因，使之具备代谢木糖的能力。基因工程常用的宿主菌种有酿酒酵母、运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)、和大肠杆菌(Escherichiacoli)。
　　酿酒酵母不能利用木糖，只能利用木酮糖。为在酿酒酵母中引入木糖—木酮糖的代谢途径，然后进一步代谢木酮糖产生乙醇，目前的做法主要为：一是在酿酒酵母中克隆并表达木糖还原酶基因xyl1和木糖醇脱氢酶基因xyl2；二是在酿酒酵母中克隆并表达细菌的木糖异构酶基因xylA[13]。因为酿酒酵母没有专一性木糖转运酶，木糖运输是由非专一性的已糖转运酶完成，而此类酶对于木糖的亲和力远低于葡萄糖，所以木糖的跨膜运输被认为是工程菌利用木糖的障碍之一。于是侯进等试图将木糖异构酶表达在酿酒酵母细胞表面，在细胞体外将木糖转化成较易运输并可被酿酒酵母直接利用的木酮糖，以绕过木糖运输困难的问题：利用酿酒酵母表面展示系统的栽体，将来源于嗜热细菌(Thermusthermophilus)的木糖异构酶基因xybt，插入到酿酒酵母蔗糖酶信号肽序列与a-凝集素的C端编码序列之间，形成融合表达框，构建重组质粒pSy.xy222，转化酿酒酵母H158。木糖葡萄糖共发酵结果显示，重组菌株木糖利用率较出发菌株提高了17.8％[19]。在生产木糖醇方面，陈璐菲等利用基于a-凝集素C末端的酵母细胞表面展示系统，构建了1株重组酿酒酵母菌株MT8-1/plCAS-His-Ctxyll[20]。由于木糖还原酶展示重组酵母存在体内氧化还原酶系，影响了转化子的酶活性检测，设计了组氨酸标签流式细胞荧光分析筛选高表达转化子，并通过木糖的转化作用证实了木糖还原酶的活性表达。HPLC分析结果表明：发酵液中98.7%的木糖被转化为木糖醇，发酵时间至96h时木糖和木糖醇并没有进入酿酒酵母参与进一步的代谢。证明了在酿酒酵母表面对木糖进行转化，以绕过木糖跨膜运输的障碍是可行的。
　　木酮糖代谢流下游的疏通也是提高木糖发酵生产乙醇的关键。酿酒酵母自身具有木酮糖代谢的下游酶系，但活性较低，限制了木糖代谢流向磷酸戊糖途径，进而影响乙醇的产率。沈煜等在酿酒酵母H158中分别引入木糖还原酶、木糖醇脱氢酶和木糖异构酶，并在此基础上超表达了木酮糖激酶。在以木糖为唯一碳源的完全培养基平板上，超表达木酮糖激酶没有使重组菌株表现出更好的生长状况。但是葡萄糖、木糖共底物限氧发酵结果显示，在表达XYL1，XYL2的重组菌株中，增加木酮糖激酶活性，木糖利用有明显提高，从5.6g/L增加到了12.4g/L，乙醇得率增加了36％，而木糖乙醇发酵得到的主要副产物木糖醇的量下降了84.9％。表明木酮糖激酶的高效表达对木糖发酵生产乙醇具有促进作用[21]。刘红梅等利用全转录工程(gTME)方法将全局转录因子sptl5随机突变并克隆表达，构建突变库。将突变基因连接到表达载体pYX212上，醋酸锂法转化入不利用木糖的酿酒酵母YPH499中，获得的重组菌株乙醇产率为32.4％和31.6％；当木糖和葡萄糖以质量比1∶1混合发酵时，木糖和葡萄糖利用率分别为91.7％和85.9％，乙醇产率为26％，副产物木糖醇的含量极低[22]。张凌燕等以从256个自然样品中筛选得到的1株可高效转化D-木糖的C.tropicalis为研究对象[23]，增加木糖醇脱氢酶表达量，以pXY212-XYL2质粒为基础栽体，构建了含有潮霉素抗性的pYX212-XYL2.Hygro，电击转化进入野生型C．tropicalis，潮霉素抗性筛选，得到的重组菌株C.tropicalisXYL2.7，比酶活达到0.5u/mgprotein，比原始菌株提高了3倍，木糖醇得率比原始菌株降低了3倍，酒精得率提高了5倍。首次通过实验验证了热带假丝酵母利用木糖产乙醇的可行性，对研究酵母利用秸秆、麦糠、谷壳等纤维质农业废弃物生产燃料乙醇具有重要启示。张清等将定点突变改造后的Thermusthermophilus木糖异构酶基因sXYLA克隆到酵母表达载体pYX212并用于转化酿酒酵母SaccharomycescerevisiaeYPH499进行表达研究[24]。而后将改造后具有良好特性的木糖异构酶基因sXLA和木酮糖激酶基因XKS1偶联，构建得到重组表达质粒pYX-sXYLAXKS1，在酿酒酵母YPH499中实现组成型共表达，结果表明，在84h时重组菌发酵液酶活达到最高。以葡萄糖和木糖为混合碳源初步进行半通氧发酵，木糖的消耗为4.75g/L，乙醇的产量为0.839g/L，分别比出发菌提高20.9%和14.8％，为酿酒酵母利用木糖发酵乙醇奠定了基础，并在一定程度上解决了XI途径中的木糖异构酶在常温下酶活不高的问题。
　　大肠杆菌是目前基因工程中研究最广泛深入的模式菌株，其发酵底物广泛、所需营养简单，主要缺陷是：pH值范围狭窄(6.0～8.0)，适应性比酵母菌差，且具有潜在的危险性。E．coli含有利用木糖的所有必需酶，最后生成乙醇的阶段是由丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶Ⅱ催化完成的，但E．coli缺乏PDC，而且ADHⅡ的水平较低[25]。王晓霞等利用PCR方法，从休哈塔假丝酵母基因组DNA扩增得到了木糖还原酶基因，并在大肠杆菌中活性表达；重组菌在诱导6h时的XR表达量最大，在以乳糖作为诱导剂时酶活最高为232.38μkat•g-1，以IPTG作为诱导剂时酶活最高为206.04/μkat•g-1[26]。
　　运动发酵单胞菌是目前唯一一种通过ED途径厌氧发酵葡萄糖的微生物，独特的代谢途径使其成为构建产乙醇工程菌的首选宿主之一。它具有发酵速度快、糖利用率和乙醇产率高、耐受高乙醇和高底物浓度等优点。但其底物范围窄，只能发酵葡萄糖、果糖和蔗糖，不能利用木糖。Mohagheghi等将发酵木糖和阿拉伯糖所需的7个基因整合到Z.mobilis染色体上的特异位点—乳酸脱氢酶基因中，获得了一株稳定的重组菌AX101，在赋予新菌株发酵利用木糖和阿拉伯糖能力的同时，也减少了副产物乳酸的生成[27]。
　　
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